Review teknik biomed

Bab I

Ekstraksi Asam Nukleat

A.  Pendahuluan

  • Tujuan dari ekstraksi atau isolasi Asam nukleat adalah memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya, sehingga dapat dianalisis dan dimodifikasi dengan teknik biologi molekuler lainnya.
  • Jika akan mengisolasi dari jaringan dan organ langkah pertama yang dilakukan adalah homogenisasi jaringan, untuk meningkatkan jumlah sel yang akan dilisiskan.
  • Langkah selanjutnya adalah permeabilisasi jaringan dengan detergen non-ionik, sehingga tidak mengikat asam nukleat, (Tween, SDS,nonidhet, laureth, dan triton).
  • Kemudian lisiskan sel untuk mengeluarkan asam nukleat dengan buffer hipotonik.
  • Langkah selanjutnya adalah degradasi dan presipitasi protein (pemanasan, enzim proteinase, dan garam chaotropic).
  • Asam nukleat dapat dipresipitasi untuk dikonsentrasikan ke dalam volume yang lebih kecil.
  • Presipitat yang dapat digunakan PEG,isopropanol,ethanol,alkohol (FENOL TIDAK BISA).
  • Kemudian masuk tahap pencucian dan solubilisasi asam nukleat.
  • Metode ekstraksi/isolasi asam nukleat dengan fenol/isoamilalkohol,khlrofom.
  • Lap.air berisi asam nukleat, lap. Antara air dan fenol (protein penghambat dan polimer seperti karbohidrat), lap. Anatara isoamilalkohol dan khlorofom berisi lemak.
  • Lakukan pencucian dengan alkohol 70% kemudian alkohol 100%. Buang sisa fenol dan garam. Limbah fenol/isoamilalkohol/khlorofom adalah toksik.

B.  Ekstraksi DNA dan C. Ekstraksi RNA

  • Metode melisiskan sel tetapi tidak memfragmentasi DNA. Pakai EDTA → mengikat ion Mg (Kofaktor DNase).
  • Jika ada dinding sel, lisiskan pake enzim (lisozim→bakteri, litikase→jamur)
  • Selanjutnya membran sel sebaiknya disolubilisasi dengan detergen. Jika proses disrupsi fisik dibutuhkan lakukan pada suhu 40C, atau pada larutan yang telah di autoclave (autoclave→menonaktifkan DNase).
  • Guanidine (HCl) atau SCN (thiosianat) dan proteinase K untuk melisiskan sel dan menonaktifkan Dnase dan Rnase.
  • Urea dan triton X100 untuk mendenaturasi protein komponen sel.
  • Setelah asam nukleat lepas dari sel, RNA dihilangkan dengan Rnase (RNA stabil thdp pemanasan→renaturisasi ketika pendinginan).
  • Agen chaotropic → GuSCN,NaI,LiCl →menghancurkan kapsul lemak dan merusak integritas sel, denaturasi protein, dan menginaktivasi nuklease.
  • Konsentrasi tinggi garam chaotropic + pH asam→ meningkatkan absorbsi asam nukleat pada matriks silika, sdgkan lemak dan protein kontaminan  tidak terikat krn afinitasx moderat.
  • Konsentrasi garam rendah+pH tinggi→melepaskan asam nukleat dari matriks silika.
  • Matrik silika→komersil→dlam bentuk seperti filter (spin column), gel (glassmilk, silika gel), suspensi (celite,plain-coarse silicate), partikel berselubung magnetik (Dynabeads).
  • CsCl dng density gradient centrifugation→isolat DNA dengan kemurnian tinggi.
  • Elektroforesis gel agarose atau spektophotometer UV→mengetahui integritas DNA.
  • DNA untai ganda (+) koefisien absorpsi 0,027, DNA untai tunggal (+) 0,02, dan RNA 0,025 µg/ml/cm pada panjang gelombang 260nm.
  • Rasio absorpsi 260/280 nm. Kontaminasi protein→>280nm.
  • Sampel DNA murni (+) rasio 260/280nm→1,8-1,9
  • Sampel RNA murni (+) 1,9-2,0
  • <1,8→ketidakmurnian signifikan pada sampel.
  • Kalibrasi terlebih dahulu dengan blank→pelarut yang digunakan untuk melarutkan asam nukleat yang diperiksa.
  • Metode ekstraksi RNA mirip dengan DNA, ttp RNA lebh pendek , dan lebih sulit rusak→disrupsi sel dapat dilakukan lebih agresif.
  • RNA mudah didigesti dengan Rnase.
  • Proses deproteinisasi>agresif→RNA sering berikatan dengan protein.
  • Penambahan DNase→hilangkan DNA.
  • Presipitasi RNA dng→etanol.
  • GuSCN→reagen yang sering digunakan krn merupakan inhibitor kuat Rnase.
  • RNase relatif stabil thdp denaturasi dng pemanasan dan ekstraksi fenol.
  • Aktivitas nuklease selama proses ekstraksi dpt dihambat dengan:
    • Suhu dibawah suhu optimum nuklease 37oC (msl 4oC)
    • Inaktivasi nuklease pada larutan sisa dan permukaan gelas dng DEPC
    • Penghilangan ion2 kofaktor dng chelating agent.
    • Inaktivasi atau penghambatan dng fenol atau garam guanidium.
  • Untuk mengisolasi mRNA yang hanya 2-5% dari RNA total, digunakan oligo(dT)-selulosa yang akan mengikat poly-A pada mRNA pada konsentrasi garam tinggi. RNA lain yang tidak berikatan dicuci, dan mRNA dilepaskan dari oligo(dT)-selulosa pada konsentrasi garam rendah.
  • DNA dapat disimpan dalam bentuk aliquot dalam -20oC atau -70oC untuk menghindari kerusakan akibat freeze-thawing.
  • Penyimpanan DNA pada 4oC→beberapa bulan saja.
  • DNA dilarutkan dalam air→kualitas memburuk (DNA bersifat asam lemah dalam air, untuk mengatasinya dilarutkan dalam buffer TE (tris-EDTA).
  • Penggunaan waktu lama dalam nitrogen cair -196oC.

 

BAB II

PCR

A.  Prinsip dasar PCR

  • Perlu DNA (sebagai cetakan), primer (oligonukleotida yang akan mengkomplementari sekuens DNA), dNTPs (blok pembangun asam nukleat), dan enzim polimerase DNA.
  • DNA untuk PCR jk tidak murni→masalah reproduksibilitasnya.
  • DNA harus bebas dari nuklease, endo-ekso proteinase, dan DNA binding protein.
  • Untuk RNA→ubah dulu jadi DNA komplemennya. Reverse transkiption PCR (RT-PCR).
  • Primer (sangat menentukan keberhasilan PCR)→baik efektif dan efisien. Yng gratis MEDUSA, Primer3, PrimerQuest,dll.
  • Primer yang baik:
    • Panjang primer 18-30 nukleotida (kecuali utk tujuan tertentu)
    • Sekuensx tidak mengandung komplementari internal
    • Dalam sepasang primer tidak ada yang berkomplementari
    • Tidak ada struktur sekunder.
    • GC:AT→seimbang.
    • Pilih daerah yang stabil untuk diamplifikasi
    • Perbedaan suhu annealing sepasang primer jangan lebih dari 5oC.
  • dNTPs sebagai pembangun komplek asam nukleat terdiri dari dATPs,dGTPs, dCTPs,dan dTTPs.
  • Enzim DNA polimerase→ memiliki aktivitas proofreading mislx, yang melakukan proofreading dari 5’-3’→TTH94, tfl, AmpliTaq.
  • Bufer reaksi PCR (1) co-solvent→menstabilisasi enzim dan atau DNA melting temperature (TM), (2) ion Mg→kofaktor aktivitas polimerase DNA thermostabil, (3) ion monovalen→NH4+, K+, dan Na+ → menstimulasi kerja DNA polimerase, melindungi muatan negatif pada gugus posfat DNA sehingga primer akan menempel.
  • Reaksi PCR:
    • Denaturasi (melting)→memisahkan double strand DNA jadi single strand (dengan pemanasan)
    • Annealing (hibridisasi)→melekatnya primer pada strand DNA
    • Elongasi→proses amplifikasi oleh primer dari 5’-3’
  • Tahapan PCR: (1) tahap awal, (2) eksponensial, (3) Plateau.
  • Visualisasi produk PCR→ mengecat DNA untai ganda dengan dari ion perak dan pewarna kimia yang mampu berinterkalasi diantara untai ganda DNA, mengecat primer atau dNTPs dengan flouresen atau hapten sebelum amplifikasi PCR.
  • Positif palsu→ primer tidak cukup selektif, suhu annealing primer terlalu rendah, terlalu banyak siklus PCR.
  • Ruangan bertekanan tinggi (agar tidak ada kontaminan dari luar yang masuk)→ berhubungan denga persiapan PCR (pengolahan spesimen, persiapan reaksi PCR, dan sintesis primer).
  • Ruangan bertekanan rendah (mencegah keluarnya aerosol yang terkontaminasi poduk PCR ke luar ruangan)→tahapan thermocycling PCR, elektroforesis gel.
  • Untuk langkah pencegahan kontaminasi→spesimen klinis, reaksi PCR, primer, dan asam nukleat disentrifugasi dahulu sebelum dibuka→mengurangi kontaminasi aerosol ktk tutup dibuka.
  • Permukaan meja dibersihkan dengan 1 N HCl secara teratur atau menggunakan sinar UV atau radiasi sinar gamma selama satu malam→menghancurkan kontaminasi aerosol.
  • Pembagian ruang laboratorium PCR:
    • Ruangan bersih→pembuatan reaksi PCR (hanya bufer dan enzim untuk reaksi PCR dan primerdan alat penunjangnya), spesimen, asam nukleat, produk PCR, plasmid, dan semua alt yang berhubungan dengan yang td disebutkan tidak boleh ada.
    • Ruangan penerimaan sampel dan atau isolassi asam nukleat→plasmid dan produk PCR tidak boleh ada (ruangan bersih ke-2)
    • Ruangan PCR→tempat alat PCR berada, tidak ada manipulasi apapun thdp sampel PCR.
    • Ruangan paska PCR→dilakukan analisis produk PCR, elektroforesis gel (resiko kontaminasi aerosol dan atau debu tinggi).

BAB III

Elektroforesis gel

  • Adalah perpidahan molekul sebagai respon terhadap medan listrik.
  • Dipengaruhi oleh: kekuatan medan listrik, muatan listrik, ukuran dan bentuk molekul, kekuatan ionik, viskositas, dan suhu medium yang digunakan oleh molekul tesbt utk berpindah.
  • Medium yang digunakan: agarose dan poliakrilamid.
  • Agarose→memisahkan molekul berukuran >100bp
  • Akrilamid→memisahkan fragmen DNA pendek <100bp.
  • DNA bermuatan negatif→bergerak dari katoda (-) ke anoda (+)
  • Jenis bufer yang digunakan berpengaruh thdp resolusi pergerakan DNA
  • Bufer TAE (tris-Acetate-EDTA)→baik utk fragmen DNA>4kb
  • TBE (tris-borate-EDTA)→baik utk fragmen DNA 0,1-3kb.
  • Untuk DNA biasanya agarose horizontal
  • Elektroforesis protein biasanya menggunakan poliakrilamid (akrilamid dan bis-akrilamid), konsentrasi total akrilamid mempengaruhi pergerakan.
  • Metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamid Gel Elektrophoresis)→ memisahkan molekul protein berdasarkan berat molekul
  • Metode IEF (Isoelectric Focusing)→memisahkan molekul protein berdasarkan isoelektriknya.
  • Gel protein dibuat terdenaturasi oleh SDS (sodium dodecyl sulphate)→yang menyebabkan protein terdenaturasi oleh panas. SDS berikatan hidrofobik dengan protein sesuai ukuran proteinnya.
  • Adanya muatan alami dari SDS membuat protein bermigrasi.
  • Visualisasi DNA→flourescent intercalacting dye EtBr (warna merah atau orange flouresen ketika diiluminasi dengan UV), SYBRGreen atau Gelstar.
  • Untuk protein→Coomassie brilliant blue atau teknik pengecata perak
  • DNA maker→Campuran fragmen DNA yang telah diketahui massa molekulnya
  • Untuk Protein→campuran protein  murni yang telah diketahui massa molekulnya

BAB V

Pengenalan enzim restriksi

  • Enzim yang digunakan bakteri untuk  melindungi diri dari infeksi DNA asing
  • Enzim EcoR1→memotong sekuens 5’-G_AATTC-3’
  • Untuk melindung DNA dalam selnya, bakteri menghasilkan enzim metilase yang memetilase basa A kedua dalam urutan sekuens tersebut (GAATTC)
  • Enzim endonuklease restriksi akan mendigest pada atau didekat segmen yang dikenali/ dimetilase oleh enzim metilase.
  • Enzim endonuklease restriksi tidak akan mendigest pada sekuens yang telah dimetilase oleh enzim metilase. Enzim metilase dan endonuklease restriksi berperan dalam sistem imun bakteri.
  • Kegunaan enzim endonuklease restriksi tergantung pada spesifitas dan frekuensi terjadinya pengenalan tempat pada sampel DNA.
  • Alu1 spesifitasnya 4 nukleotida→A_GTC
  • Not1 spesifitasnya 8 nukleotida→GC_GGCCGC
  • Penggunaan enzim endonuklease restriksi→RFLP (Restriction Fragment Long Polymorphisms) sidik jari DNA, Kloning.
  • Hidrolisis endonuklease adalah reksi spontan, tidak membutuhkan ATP.
  • Yang paling menentukan dari aktivitas enzim endonuklease restriksi adalah konsentrasi ionik dalam bufer NaCl→low (20mM), medium (100mM), high (250mM)

 

One thought on “Review teknik biomed

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s